ПОЛІМОРФІЗМ ДІЛЯНКИ ITS1–5.8S–ITS2 У ДВОХ КУЛЬТИВАРІВ PETUNIA × ATKINSIANA
DOI:
https://doi.org/10.31861/biosystems2026.02.375Ключові слова:
ампліконне секвенування, внутрішньогеномний поліморфізм, гібридизація, ідентифікація культиварів, молекулярні маркери, ПЛР-химер, рибосомна ДНК, риботип, ITS1–5.8S–ITS2, Petunia × atkinsianaАнотація
Ділянка ITS1–5.8S–ITS2 35S рДНК є одним із найпоширеніших молекулярних маркерів для ідентифікації, баркодування та філогенетичного аналізу рослин. Проте 35S рДНК представлена в геномі великою кількістю тандемних копій, які можуть відрізнятися між собою, а пряме секвенування ПЛР-продуктів не дозволяє виявити такий внутрішньогеномний поліморфізм. Особливо важливим це питання є для організмів гібридного походження, до яких належить петунія гібридна (Petunia × atkinsiana) – одна з найпоширеніших декоративних культур і модельний об’єкт біології рослин. Метою роботи було охарактеризувати внутрішньогеномний поліморфізм ділянки ITS1–5.8S–ITS2 у двох комерційних культиварів P. × atkinsiana – «Petit F1 Violet» (зразок Pt7) і «Wine Red» (зразок WR1) – та оцінити можливість використання ампліконного секвенування для їх ідентифікації і з’ясування походження. Ділянку ITS1–5.8S–ITS2 ампліфікували з геномної ДНК праймерами з двонуклеотидними баркодами, суміш ампліконів двох зразків секвенували парними прочитаннями на платформі Illumina MiSeq. Після контролю якості та розподілу за зразками отримано 364 ріди для Pt7 і 260 для WR1 завдовжки 596 нт. Химерні послідовності виявляли за алгоритмом UCHIME, філогенетичне дерево будували методом максимальної правдоподібності із залученням референсних послідовностей видів родів Petunia і Calibrachoa з бази даних GenBank. В обох зразках виявлено значний поліморфізм: 220 варіантів послідовностей у Pt7 і 190 у WR1. Дванадцять основних риботипів (R1–R12), представлених щонайменше п’ятьма рідами, охоплювали 30,8 % рідів. За наявністю специфічних мутацій ці риботипи розподілилися між двома класами: класом I (R1, R3–R5, R7, R8), подібним до послідовностей видів комплексу P. integrifolia, і класом II (R2), подібним до P. axillaris, P. exserta та P. occidentalis. Найпоширеніші риботипи R1 і R2 відрізнялися 20 замінами нуклеотидів і трьома однонуклеотидними інделами, переважно в ITS2. На філогенетичному дереві риботипи двох класів увійшли до різних клад із високою статистичною підтримкою, що підтверджує успадкування двох варіантів ITS від різних батьківських видів. П’ять риботипів (R6, R9–R12), виявлених лише в Pt7, мали мозаїчну будову; для чотирьох із них аналіз UCHIME вказує на походження внаслідок утворення ПЛР-химер між R1 і R2. Склад риботипів культиварів суттєво різнився: у Pt7 переважали R1 (44,4 %) і R2 (31,6 %), тобто були представлені обидва класи, тоді як у WR1 майже всі ріди основних риботипів належали до класу I з переважанням R3 (39,0 %) і R4 (23,7 %), а частка R2 становила лише 1,7 %. Отже, профілі риботипів ITS1–5.8S–ITS2, отримані методом ампліконного секвенування, дозволяють чітко розрізняти досліджені культивари і можуть бути використані для ідентифікації культиварів петунії та вивчення їх походження.
Посилання
1. Álvarez, I., Wendel, J.F. (2003). Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Mol Phylogenet Evol, 29 (3), 417–434. https://doi.org/10.1016/S1055-7903(03)00208-2
2. Bailey, C.D., Carr, T.G., Harris, S.A., Hughes, C.E. (2003). Characterization of angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes. Mol Phylogenet Evol, 29 (3), 435–455. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2003.08.021
3. Baldwin, B.G., Sanderson, M.J., Porter, J.M., Wojciechowski, M.F., Campbell, C.S., Donoghue, M.J. (1995). The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. Ann Missouri Bot Gard, 82 (2), 247–277. https://doi.org/10.2307/2399880
4. Bombarely, A., Moser, M., Amrad, A., et al. (2016). Insight into the evolution of the Solanaceae from the parental genomes of Petunia hybrida. Nat Plants, 2, 16074. https://doi.org/10.1038/nplants.2016.74
5. Campbell, C.S., Wojciechowski, M.F., Baldwin, B.G., Alice, L.A., Donoghue, M.J. (1997). Persistent nuclear ribosomal DNA sequence polymorphism in the Amelanchier agamic complex (Rosaceae). Mol Biol Evol, 14 (1), 81–90. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.molbev.a025705
6. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. (2018). fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics, 34 (17), i884–i890. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty560
7. Cronn, R., Cedroni, M., Haselkorn, T., Grover, C., Wendel, J.F. (2002). PCR-mediated recombination in amplification products derived from polyploid cotton. Theor Appl Genet, 104 (2), 482–489. https://doi.org/10.1007/s001220100741
8. Dover, G. (1982). Molecular drive: a cohesive mode of species evolution. Nature, 299, 111–117. https://doi.org/10.1038/299111a0
9. Edgar, R.C., Haas, B.J., Clemente, J.C., Quince, C., Knight, R. (2011). UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics, 27 (16), 2194–2200. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr381
10. Eickbush, T.H., Eickbush, D.G. (2007). Finely orchestrated movements: evolution of the ribosomal RNA genes. Genetics, 175 (2), 477–485. https://doi.org/10.1534/genetics.107.071399
11. Forbes, S. (2017). Greenspace: Why we should praise Petunias. The Adelaide Review. https://www.adelaidereview.com.au/latest/opinion/2017/02/13/greenspace-praise-petunias/
12. Gamborg, O.L., Miller, R.A., Ojima, K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res, 50 (1), 151–158. https://doi.org/10.1016/0014-4827(68)90403-5
13. Gerats, T., Vandenbussche, M. (2005). A model system for comparative research: Petunia. Trends Plant Sci, 10 (5), 251–256. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2005.03.005
14. Griesbach, R.J. (2007). Petunia. In: Anderson, N.O. (ed.) Flower Breeding and Genetics. Dordrecht: Springer. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-4428-1_11
15. Grimm, G.W., Schlee, M., Komarova, N.Y., Volkov, R.A., Hemleben, V. (2005). Low-level taxonomy and intrageneric evolutionary trends in higher plants. In: From plant taxonomy to evolutionary biology. Nova Acta Leopold NF, 92 (342), 129–145.
16. Guo, Y., Warner, R.M. (2020). Dissecting genetic diversity and genomic background of Petunia cultivars with contrasting growth habits. Hortic Res, 7, 155. https://doi.org/10.1038/s41438-020-00373-2
17. Hemleben, V., Grierson, D., Borisjuk, N., Volkov, R.A., Kovařík, A. (2021). Personal perspectives on plant ribosomal RNA genes research: from precursor-rRNA to molecular evolution. Front Plant Sci, 12, 797348. https://doi.org/10.3389/fpls.2021.797348
18. Hoang, D.T., Chernomor, O., von Haeseler, A., Minh, B.Q., Vinh, L.S. (2018). UFBoot2: improving the ultrafast bootstrap approximation. Mol Biol Evol, 35 (2), 518–522. https://doi.org/10.1093/molbev/msx281.
19. Hollingsworth, P.M., Graham, S.W., Little, D.P. (2011). Choosing and using a plant DNA barcode. PLoS ONE, 6 (5), e19254. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0019254
20. Kalyaanamoorthy, S., Minh, B.Q., Wong, T.K.F., von Haeseler, A., Jermiin, L.S. (2017). ModelFinder: fast model selection for accurate phylogenetic estimates. Nat Methods, 14 (6), 587–589. https://doi.org/10.1038/nmeth.4285
21. Katoh, K., Rozewicki, J., Yamada, K.D. (2019). MAFFT online service: multiple sequence alignment, interactive sequence choice and visualization. Brief Bioinform, 20 (4), 1160–1166. https://doi.org/10.1093/bib/bbx108
22. Minh, B.Q., Schmidt, H.A., Chernomor, O., Schrempf, D., Woodhams, M.D., von Haeseler, A., Lanfear, R. (2020). IQ-TREE 2: new models and efficient methods for phylogenetic inference in the genomic era. Mol Biol Evol, 37 (5), 1530–1534. https://doi.org/10.1093/molbev/msaa015
23. Murashige, T., Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 15 (3), 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x
24. Nieto Feliner, G., Rosselló, J.A. (2007). Better the devil you know? Guidelines for insightful utilization of nrDNA ITS in species-level evolutionary studies in plants. Mol Phylogenet Evol, 44 (2), 911–919. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2007.01.013
25. Panchuk, I.I., Volkov, R.A. (2007). Practical course in molecular genetics [Praktykum z molekuliarnoi henetyky]. Chernivtsi: Ruta. [in Ukrainian].
26. Poczai, P., Hyvönen, J. (2010). Nuclear ribosomal spacer regions in plant phylogenetics: problems and prospects. Mol Biol Rep, 37 (4), 1897–1912. https://doi.org/10.1007/s11033-009-9630-3.
27. Porebski, S., Bailey, L.G., Baum, B.R. (1997). Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol Biol Rep, 15 (1), 8–15. https://doi.org/10.1007/BF02772108.
28. Rognes, T., Flouri, T., Nichols, B., Quince, C., Mahé, F. (2016). VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics. PeerJ, 4, e2584. https://doi.org/10.7717/peerj.2584
29. Saei, A., Hunter, D., Hilario, E., et al. (2025). Chromosome-level genome assembly and annotation of Petunia × atkinsiana. Sci Data, 12, 1262. https://doi.org/10.1038/s41597-025-05553-0
30. Segatto, A.L., Ramos-Fregonezi, A.M., Bonatto, S.L., Freitas, L.B. (2014). Molecular insights into the purple-flowered ancestor of garden petunias. Am J Bot, 101 (1), 119–127. https://doi.org/10.3732/ajb.1300223
31. Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. (2016). SeqKit: a cross-platform and ultrafast toolkit for FASTA/Q file manipulation. PLoS ONE, 11 (10), e0163962. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0163962
32. Song, J., Shi, L., Li, D., et al. (2012). Extensive pyrosequencing reveals frequent intra-genomic variations of internal transcribed spacer regions of nuclear ribosomal DNA. PLoS ONE, 7 (8), e43971. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043971
33. Vandenbussche, M., Chambrier, P., Rodrigues Bento, S., Morel, P. (2016). Petunia, your next supermodel? Front Plant Sci, 7, 72. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00072
34. Volkov, R.A., Borisjuk, N.V., Panchuk, I.I., Schweizer, D., Hemleben, V. (1999). Elimination and rearrangement of parental rDNA in the allotetraploid Nicotiana tabacum. Mol Biol Evol, 16 (3), 311–320. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.molbev.a026112
35. Volkov, R.A., Komarova, N.Y., Hemleben, V. (2007). Ribosomal DNA in plant hybrids: inheritance, rearrangement, expression. Syst Biodivers, 5 (3), 261–276. https://doi.org/10.1017/S1477200007002447
36. Volkov, R.A., Panchuk, I.I., Borisjuk, N.V., Hosiawa-Baranska, M., Maluszynska, J., Hemleben, V. (2017). Evolutional dynamics of 45S and 5S ribosomal DNA in ancient allohexaploid Atropa belladonna. BMC Plant Biol, 17, 21. https://doi.org/10.1186/s12870-017-0978-6
37. Wang, W., Zhang, X., Garcia, S., Leitch, A.R., Kovařík, A. (2023). Intragenomic rDNA variation – the product of concerted evolution, mutation, or something in between? Heredity, 131 (3), 179–188. https://doi.org/10.1038/s41437-023-00634-5.
38. Zeboudj, F., Kabbaj, A., Sossey Alaoui, K., Peltier, D., Tagmount, A., Raquin, C., Darmency, M., Maizonnier, D., Dulieu, H., Bervillé, A. (1994). Variation of ribosomal DNA and inheritance of polymorphisms in 6 Petunia hybrida hort lines. Agronomie, 14 (8), 485–495. https://doi.org/10.1051/agro:19940801
