БЕЗПЕЧНІ МЕТОДИ ВІЗУАЛІЗАЦІЇ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ ПІСЛЯ ГЕЛЬ-ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ
DOI:
https://doi.org/10.31861/biosystems2025.01.009Ключові слова:
бромід етидію, гель-електрофорез, ідентифікація нуклеїнових кислот, , охорона праці та безпека лабораторії, флуоресцентні барвникиАнотація
У статті розглянуто сучасні підходи до візуалізації нуклеїнових кислот після гель-електрофорезу з акцентом на безпечні для здоров’я та довкілля барвники. Традиційно для детекції ДНК використовували інтеркалюючі флуоресцентні барвники, зокрема бромід етидію (EtBr), який, попри високу ефективність, характеризується значною токсичністю, мутагенною активністю та екологічною небезпекою. У статті детально проаналізовано механізми шкідливої дії EtBr на клітини та надано рекомендації з безпечної роботи з цією сполукою, включаючи утилізацію та заходи індивідуального захисту.
Також, аналізуються доступні на ринку альтернативні сучасні барвники, як-от SYBR Green I/II, GelRed™, GelGreen™, Midori Green та інші, які часто демонструють вищу чутливість та можуть застосовуватись без використання жорсткого ультрафіолетового опромінення. Крім того, такі сполуки не пошкоджують нуклеїнові кислоти та не пригнічують ензиматичні реакції, що важливо для успішності подальших експериментальних маніпуляцій, таких як ПЛР, клонування чи сиквенування. Проведено порівняльну характеристику комерційних барвників з оцінкою їх переваг, недоліків, спектральних властивостей та вартості. Попри вищу закупівельну ціну, затрати на утилізацію та ризики для персоналу при використанні сучасних барвників нижчі, ніж при роботі з EtBr. Перехід на безпечні альтернативи сприяє підвищенню ефективності, чутливості й безпеки лабораторної практики в молекулярній біології і відповідає сучасним екологічним стандартам.
Посилання
1. Alaranta, J. M., Truong, K. N., Matus, M. F., Malola, S. A., Rissanen, K. T., Shroff, S. S., ... & Lahtinen, T. M. (2023). Optimizing the SYBR green related cyanine dye structure to aim for brighter nucleic acid visualization. Dyes and Pigments, 208, 110844ac. https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2022.110844
2. Alexeeff, G.V., Kilgore, W.W., & Li, M. (1990). Ethylene dibromide: toxicology and risk assessment. Reviews of environmental contamination and toxicology, 112, 49-122. https://doi.org/10.1007/978-1-4612-3342-8_2
3. Amirijavid, S., & Mohammadi, M. (2014). Toxicity of the ethidium bromide on germination of wheat, alfalfa and tomato. Inter. Invention J. Agri. Soil Sci, 2(5), 69-74.
4. Del Giudice, L., Wolf, K., Schwemmier, W., & Schenk, H. E. A. (1980). Evidence for a joint control of nuclear and mitochondrial DNA synthesis in the petite negative yeast Schizosaccharomyces pombe. Endocytobiology: Endosymbiosis and Cell Biology, 1, 779-790.
5. Fogg, J. M., Judge, A., Stricker, E., Chan, H. L., & Zechiedrich, E. L. (2021). Supercoiling and looping promote DNA base accessibility and coordination among distant sites. Biophysical Journal, 120(3), 221a-222a. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2020.11.1484
6. Gupta, R.S., & Goldstein, S. (1982). Human fibroblast strains showing increased sensitivity or resistance to ethidium bromide. Mutation research, 105 3, 183-8. https://doi.org/10.1016/0165-7992(82)90009-4
7. Kulyk, O. G., Kolosova, O. S., Svoiakov, R. P., Kobzev, D. V., Hovor, I. V., Kraievska, I. M., ... & Tatarets, A. L. (2022). Novel dimeric dyes based on the acridine orange chromophore: Synthesis, characterization and application in real-time PCR. Dyes and Pigments, 200, 110148. https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2022.110148
8. Kuypers, N. J., James, K. T., Enzmann, G. U., Magnuson, D. S., & Whittemore, S. R. (2013). Functional consequences of ethidium bromide demyelination of the mouse ventral spinal cord. Experimental neurology, 247, 615-622. https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2013.02.014
9. Lai, J. S., & Herr, W. (1992). Ethidium bromide provides a simple tool for identifying genuine DNA-independent protein associations. Proceedings of the National Academy of Sciences, 89(15), 6958-6962. https://doi.org/10.1073/pnas.89.15.6958
10. McNerney, R. (2002) Mutagens in the medical laboratory: what can be done? Africa health, 25. (1) 14-15
11. Medina, O. A., Oviedo, F. R., González, Y. N., & Obregón, R. R. (2024). GelRed dye for staining nucleic acids in agarose gel was used in the molecular biology laboratory. Revista Torreón Universitario, 13(38), 145–150. https://doi.org/10.5377/rtu.v13i38.19325
12. Nafisi, S., Saboury, A. A., Keramat, N., Neault, J. F., & Tajmir-Riahi, H. A. (2007). Stability and structural features of DNA intercalation with ethidium bromide, acridine orange and methylene blue. Journal of Molecular Structure, 827(1-3), 35-43. https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2006.05.004
13. Olmsted III, J., & Kearns, D. R. (1977). Mechanism of ethidium bromide fluorescence enhancement on binding to nucleic acids. Biochemistry, 16(16), 3647-3654.
14. Panchuk, I.I. & Volkov, R.A. (2007). A practical course in molecular genetics. [Praktykum z molekuliarnoi henetyky.. Chernivtsi: Ruta. 120 p. [in Ukrainian]
15. Parkash, S., Parminder, K. N., Akanksha (2024). A review on toxicity and degradation of ethidium bromide (EtBr). Environment and Ecology, 42 (2B), 851–854. https://doi.org/10.60151/envec/KWJT3358
16. Maniatis, T., Fritsch, E. F., & Sambrook, J. (1982). Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory.
17. Singh, S., & Singh, A. N. (2018). Ethidium bromide: Is a stain turning into a pollutant? A synthesis on its status, waste management, monitoring challenges and ecological risks to the environment. Int. J. Res. Anal. Rev, 4, 226-233.
18. Tuma, R. S., Beaudet, M. P., Jin, X., Jones, L. J., Cheung, C. Y., Yue, S., & Singer, V. L. (1999). Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical biochemistry, 268(2), 278-288. https://doi.org/10.1006/abio.1998.3067
19. Usifo, O. R., & Obi, F. O. (2024). Dose-dependent reduction of rat colon antioxidant enzyme activities and increased thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) by ethidium bromide. Scientia Africana, 23(2), 42-47. https://doi.org/10.4314/sa.v23i2.4
20. Vardevanyan, P. O., Antonyan, A. P., Parsadanyan, M. A., Davtyan, H. G., & Karapetyan, A. T. (2003). The binding of ethidium bromide with DNA: interaction with single-and double-stranded structures. Exp Mol Med, 35(6), 527-533. https://doi.org/10.1038/emm.2003.68
21. Yoshikawa, H., Ogasawara, N., & Seiki, M. (1980). Initiation of DNA replication in Bacillus subtilis: IV. The effect of an intercalating dye, ethidium bromide. Molec. Gen. Genet., 179, 265-272.
